微生物組（Microbiome）是微生物在自然界中的存在形式，它們無(wú)處不在、無(wú)所不能，與我們每個(gè)人乃至海洋、土壤、大氣的健康都息息相關(guān)。在微生物組的內(nèi)部，不同種類的微生物之間存在著復(fù)雜、精妙的相互作用與影響，這一跨物種的細(xì)胞間代謝互作網(wǎng)絡(luò)是群落功能和進(jìn)化的基礎(chǔ)。然而由于自然界中絕大部分微生物尚難以培養(yǎng)，而且細(xì)胞在純培養(yǎng)狀態(tài)往往無(wú)法體現(xiàn)其“原位”功能，因此“如何原位考察細(xì)胞間代謝互作”一直是微生物組方法學(xué)研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)之一。近日，中科院青島能源所與牛津大學(xué)合作發(fā)明了“反向拉曼標(biāo)記技術(shù)”，可在單細(xì)胞水平上示蹤微生物群落中細(xì)胞代謝互作，為微生物組原位功能研究提供了新思路與新平臺(tái)。該工作近期發(fā)表于Analytical Chemistry。
單細(xì)胞拉曼成像與活細(xì)胞穩(wěn)定同位素標(biāo)記相結(jié)合的技術(shù)，能分辨群落內(nèi)代謝特定底物的細(xì)胞，從而重建“食物鏈”的時(shí)空特征。然而自然界中的底物種類幾近無(wú)限，許多人們感興趣的底物無(wú)法或難以用穩(wěn)定同位素標(biāo)記，這大大限制了該技術(shù)的應(yīng)用。針對(duì)上述瓶頸，中科院青島能源所單細(xì)胞中心王允帶領(lǐng)的研究小組打破了傳統(tǒng)拉曼標(biāo)記策略的思維定勢(shì)，先使用13C標(biāo)記的廣譜碳源（如葡萄糖等）把群落中所有細(xì)胞都“喂飽”，再將碳源切換為未經(jīng)標(biāo)記的目標(biāo)底物，然后通過(guò)觀測(cè)單細(xì)胞拉曼光譜中目標(biāo)底物代謝并替換細(xì)胞中13C標(biāo)記化合物的過(guò)程，也就是測(cè)量13C拉曼峰反向漂移到12C位置的動(dòng)態(tài)特征，從而分辨群落中特異性地代謝目標(biāo)底物的細(xì)胞。同時(shí)，通過(guò)重水飼喂，觀測(cè)2180 cm-1附近C-D峰的出現(xiàn)，以同時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的綜合代謝活性。結(jié)合上述兩種特性，可成像與重建細(xì)胞間的相互作用及底物傳遞過(guò)程（圖1）。
在此基礎(chǔ)上，研究人員構(gòu)建了由不動(dòng)桿菌（Acinetobacter spp.）與大腸桿菌（E. coli）組成的模擬菌群，它們是人體、醫(yī)院和自然界中均常見(jiàn)的機(jī)會(huì)致病菌，且其耐藥性日益嚴(yán)重，已引起臨床和微生物學(xué)者的關(guān)注。反向拉曼標(biāo)記技術(shù)結(jié)合“碳源-重水”雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在檸檬酸作為唯一碳源的共培養(yǎng)體系中，不動(dòng)桿菌可快速利用檸檬酸，并展現(xiàn)了較高的綜合代謝活性。大腸桿菌“單身”時(shí)完全不能利用檸檬酸，但在與不動(dòng)桿菌“同居”時(shí)卻表現(xiàn)出了一定的綜合代謝活性。代謝物組分析表明，在雙方“同居”時(shí)，不動(dòng)桿菌代謝檸檬酸的產(chǎn)物苯丙氨酸及腐胺可被大腸桿菌利用，含量雖不足以支撐后者的細(xì)胞分裂，但能保持其基礎(chǔ)水平的綜合代謝活性。因此該方法可在單細(xì)胞水平上解析與示蹤群落中細(xì)胞之間的代謝互作與共生關(guān)系。
當(dāng)前微生物組功能分析的主要工具，如元基因組、元轉(zhuǎn)錄組、元代謝組、穩(wěn)定性同位素核酸探針（DNA/RNA-SIP）技術(shù)以及高通量培養(yǎng)技術(shù)等，通常難以揭示原位狀態(tài)下群落中的各個(gè)成員在代謝功能上的互作關(guān)系。因此這一“反向拉曼標(biāo)記技術(shù)”和雙標(biāo)記策略具備獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，有望作為一種共性手段與新工具，服務(wù)于人體健康、海洋生態(tài)、環(huán)境修復(fù)、生物發(fā)酵等廣泛領(lǐng)域的微生物組研究。
上述工作由英國(guó)牛津大學(xué)工程系黃巍和中科院青島能源所單細(xì)胞中心徐健聯(lián)合主持，獲得了基金委、中科院土壤微生物先導(dǎo)專項(xiàng)和中科院生物高通量檢測(cè)分析服務(wù)網(wǎng)絡(luò)（STS）等項(xiàng)目的支持。
附錄：Wang Y., Song Y., Tao Y., Muhamadali H., Goodacre R., Zhou N.Y., Preston G.M., Xu J.*, Huang W.E.* (2016). Reverse and multiple stable isotope probing to study bacterial metabolism and interactions at the single cell level. Analytical Chemistry, 88: 9443-9450.
