近日，實驗海洋生物學(xué)重點實驗室張琳琳團隊在牡蠣基因組編輯方面獲新進展，相關(guān)成果在學(xué)術(shù)期刊Frontiers in Marine Science發(fā)表。
隨著對高品質(zhì)動物蛋白需求的迅速增長，水產(chǎn)養(yǎng)殖正成為人類食用海產(chǎn)品的主要來源。然而，與許多成熟的陸生牲畜和作物系統(tǒng)相比，大多數(shù)水產(chǎn)養(yǎng)殖物種育種仍處于馴化的早期階段。傳統(tǒng)的育種方式，如選擇、雜交和標記輔助育種系統(tǒng)，已經(jīng)推進了水產(chǎn)養(yǎng)殖物種經(jīng)濟性狀（包括抗病性、營養(yǎng)價值和生長質(zhì)量等）的遺傳改良。基因組編輯技術(shù)是近年來研究基因功能和解析性狀最直接有效的方法，其中CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)因具有操作簡單、靶點選擇廣、成本低、效率高等優(yōu)點，為重要水產(chǎn)物種經(jīng)濟性狀的遺傳解析和良種培育提供了最直接有力的工具。
牡蠣為世界大宗水產(chǎn)養(yǎng)殖貝類，但和水產(chǎn)魚類相比，基因組編輯育種技術(shù)在牡蠣中應(yīng)用還處于起步階段。針對牡蠣卵徑小（~50 m）、顯微操作難、幼蟲死亡率高、間接發(fā)育時間時間長以及在獲得可遺傳純系方面難度大、成本高、耗時長的難題，中科院海洋所張琳琳研究團隊經(jīng)過長期的研究攻關(guān)，搭建了一套基于電穿孔的Cas9/sgRNA復(fù)合物高通量遞送和突變體快速檢測的技術(shù)平臺，成功實現(xiàn)了對牡蠣（Crassostrea gigas angulate）基因組中標記基因（ -tubulin）的高效編輯。
基于電穿孔的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)和突變表型快速檢測平臺示意圖
研究采用作者前期研發(fā)的“長片段缺失鑲嵌性突變技術(shù)”(Zhang L., et al, 2016, Nature Communications; Zhang L., et al., 2017, PNAS)。通過同時電穿孔多個靶基因sgRNAs，研究人員在長牡蠣靶向基因中檢測到超過300 bp的長片段缺失突變，這使得研究人員可以使用PCR和常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳對突變體進行快速篩選和基因分型。這種同時傳遞兩個以上sgRNAs以獲得長片段缺失的策略是一個顯著的改進，大大簡化了基因組編輯基因型檢測的工作流程。此外，利用原位雜交和行為學(xué)分析等表型檢測手段，研究人員在牡蠣G0代幼蟲中觀察到了表型的鑲嵌型突變（纖毛的縮短、缺失）和運動能力下降。這種鑲嵌型突變有利于研究人員在G0代個體中對突變表型進行快速的鑒別，同時也能規(guī)避目標基因完全缺失導(dǎo)致的胚胎致死性。該研究在海洋經(jīng)濟貝類牡蠣中建立了基于電穿孔和長片段缺失鑲嵌性突變的CRISPR/Cas9基因編輯平臺，可為今后基于CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)在海洋貝類中開展基因功能研究提供有益的參考，同時也為牡蠣以及其他水產(chǎn)養(yǎng)殖物種的基因組編輯育種提供有力的工具。
CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的長牡蠣 -tubulin基因的長片段缺失
CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的長牡蠣鑲嵌型突變的纖毛表型
海洋研究所實驗海洋生物學(xué)重點實驗室博士后產(chǎn)久林和碩士研究生張韋為論文的共同第一作者，張琳琳研究員為通訊作者，實驗海洋生物學(xué)重點實驗室科研助理許悅、研究生薛雨、吳富村副研究員、張國范研究員和李莉研究員參與了該項目。研究得到了山東省“海洋生命資源綠色發(fā)展技術(shù)與應(yīng)用”工作站，中科院先導(dǎo)專項B和國家海外引才計劃青年項目等項目的資助。
相關(guān)成果如下：
1.Chan, J.#, Zhang, W.#, Xu, Y., Xue, Y. & Zhang, L.* (2022). Electroporation-based CRISPR/Cas9 mosaic mutagenesis of -tubulin in the cultured oyster. Frontiers in Marine Science, 9: 912409. doi: 10.3389/fmars.2022.912409.
2.張琳琳，許悅，張韋，產(chǎn)久林。快速獲得基因型和表型突變的CRISPR/Cas9基因敲除方法及應(yīng)用，專利申請?zhí)?02210378237.8。
3.張琳琳，張韋，許悅，產(chǎn)久林。長牡蠣 -tubulin基因的電穿孔基因編輯方法及應(yīng)用，專利申請?zhí)?02210378335.1。
4.張琳琳，許悅，吳富村。一種皺紋盤鮑CRISPR/Cas9基因編輯的方法，專利申請?zhí)?02111053880.5。
5.Zhang, L., Mazo-Vargas, A. & Reed R.* (2017). A single master regulatory gene coordinates the evolution and development of butterfly color and iridescence. Proceedings of the National Academy of the USA, 114(40):10707-12.
6.Zhang, L. & Reed R.D.* (2016). Genome editing in butterflies reveals that spalt promotes and Distal-less represses eyespot colour patterns. Nature Communications, 7, 11769.
