纖維小體是細菌分泌的高效降解木質(zhì)纖維素的多酶復合體，其高效降解機制及產(chǎn)纖維小體細菌的遺傳改造是木質(zhì)纖維素降解利用研究中的重要方向之一。熱纖梭菌的Cel48S是其纖維小體的主要外切葡聚糖酶，是其纖維小體中含量最高的組分，在纖維素降解過程中起著關(guān)鍵作用。但是，Cel48S的內(nèi)在性質(zhì)使得對Cel48S的純化存在很大的困難，文獻中對該酶的性質(zhì)鑒定報道存在很多相互矛盾之處，與該酶在纖維小體中的重要作用并不相符，這使人們難以深入揭示纖維小體的高效降解機制。青島能源所代謝物組學團隊崔球研究員、馮銀剛研究員、劉亞君副研究員等基于前期開發(fā)的熱纖梭菌遺傳改造工具，通過對纖維小體的定向改造，實現(xiàn)了對其原位Cel48S催化結(jié)構(gòu)域的高效純化，從而成功的對Cel48S的酶學與結(jié)構(gòu)性質(zhì)進行了系統(tǒng)解析，揭示了Cel48S在纖維小體中的真正作用。相關(guān)成果已于2018年1月13日在線發(fā)表于Biotechnology for Biofuels （Liu YJ, et al, 2018, 11:6）。
木質(zhì)纖維素水解糖化是實現(xiàn)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的高值利用的第一步，是國內(nèi)外的研究熱點。為了打破國外酶制劑技術(shù)壟斷、突破糖化技術(shù)瓶頸，代謝物組學團隊長期致力于開發(fā)基于熱纖梭菌纖維小體的新型整合生物糖化技術(shù)路線。在這一路線框架下，需要通過對纖維小體這一多酶復合體的機制解析以及定向改良從而獲得高效的全菌催化劑。為此，代謝物組學團隊針對梭菌系統(tǒng)地開發(fā)了非模式微生物基因操作工具(J Microbiol Methods, 2012, 89: 201-8.; PloS One, 2013, 8:e69032; Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98: 313-23.)，在熱纖梭菌中實現(xiàn)了快速、準確的基因敲除、過表達和精準編輯，完成了對熱線梭菌纖維小體腳架蛋白的功能貢獻、解除纖維小體反饋抑制的定向改造（Biotechnol Biofuels, 2015, 8: 36; Biotechnol Biofuels 2017, 10: 124）等系列工作。同時，團隊建立了成熟的X射線晶體學和生物大分子核磁共振等蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析平臺，完成了多個纖維小體組分和工業(yè)酶催化機制的研究（J Struct Biol, 2014, 188: 188-193; Appl Microbiol Biotechnol, 2015, 100: 2203–2212）。在完善的遺傳操作平臺和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析平臺的基礎(chǔ)之上，研究人員對纖維小體關(guān)鍵組分Cel48S進行了更系統(tǒng)深入的研究。
作為熱纖梭菌纖維小體中含量最高的的關(guān)鍵酶組分，Cel48S的酶學性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特點一直受到廣泛的關(guān)注。團隊前期通過核磁共振方法修正了文獻中關(guān)于Cel48S的組裝模塊的結(jié)構(gòu)，對纖維小體的組裝方式有了新的認識（J Struct Biol, 2014, 188: 188-193）。對于Cel48S的催化模塊，由于難于異源表達，與纖維小體結(jié)合緊密難以從原位分離，文獻中對其性質(zhì)的報道相互矛盾，該酶在纖維小體中的真正作用并未得到有效闡明。為了解決這一問題，研究人員使用前期建立的熱纖梭菌精準遺傳操作工具，通過在Cel48S的催化結(jié)構(gòu)域后面插入編碼組氨酸標簽和終止密碼子的序列，實現(xiàn)了將Cel48S的催化結(jié)構(gòu)域從纖維小體中分離并從培養(yǎng)物上清中的一步直接純化。在此基礎(chǔ)上，通過酶學測定和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，確定了天然Cel48S的高活性、結(jié)晶纖維素的底物偏好以及底物偶聯(lián)的誘導契合效應(yīng)，真正徹底闡明了纖維小體關(guān)鍵組分Cel48S的結(jié)構(gòu)功能特性。同時，本研究提供了一個基于精準遺傳操作實現(xiàn)分離純化原位的纖維小體或其他分泌蛋白的方法，為進一步研究纖維小體木質(zhì)纖維素降解機制及構(gòu)建木質(zhì)纖維素糖化的定向改良菌株提供了范例和基礎(chǔ)。
相關(guān)系列研究得到了國家科技支撐計劃、國家自然科學基金委員會以及山東省糖產(chǎn)業(yè)科學技術(shù)重點實驗室聯(lián)盟建設(shè)任務(wù)的資助。（文/圖 劉亞君 馮銀剛）
圖1. 熱纖梭菌Cel48S定向改造示意圖（a）、Cel48S底物偏好性（b）及結(jié)構(gòu)分析（c）
原文鏈接：
https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-1009-4
Liu, Y.-J., S. Liu, S. Dong, R. Li, Y. Feng and Q. Cui (2018). "Determination of the native features of the exoglucanase Cel48S from Clostridium thermocellum." Biotechnology for Biofuels 11(1).
